胞内分子的染色和检测有助于识别细胞亚群及状态。与传统表面抗体染色不同正规配资炒股，流式细胞术分析胞内蛋白需先固定细胞以稳定膜结构，再破膜使抗体进入结合胞内抗原。流式质谱不仅检测细胞表面标志，还能分析胞内及核内成分，且通道数量多，支持同时检测单细胞上多个参数，无需电压调节和补偿，极大提升检测能力。
传统荧光流式与流式质谱
一、胞内因子染色方案
以下是胞内细胞因子染色的分步骤流程：
1.细胞激活与刺激：
静息状态下的T、B细胞因子表达极低，需体外激活以诱导细胞因子产生。常用刺激剂为PMA和离子霉素，共同激活PKC，促使T细胞活化。刺激时加入蛋白转运抑制剂（如Brefeldin A或monensin），防止细胞因子分泌，保持胞内积累。通常在37℃、5% CO2条件下刺激4-6小时。
2.细胞固定：
展开剩余74%若需同时进行表面marker染色，先完成表面染色后，加入Fixation Buffer固定细胞，室温避光孵育20分钟。离心去除上清，细胞可暂时保存于4℃或-80℃（使用适当保存液）。
3.细胞破膜：
用1×Permeabilization Wash Buffer重悬固定细胞，350×g离心5-10分钟，弃上清，重复清洗一次。破膜步骤使抗体能进入细胞内结合目标抗原。
4.胞内染色：
用1×Permeabilization Wash Buffer重悬细胞，加入对应的抗体，室温避光孵育20分钟。若使用生物素化抗体，需再加入链霉亲和素偶联荧光素的二抗孵育。随后清洗两次，弃上清。
5.样本准备与检测：
最后用Cell Staining Buffer重悬细胞，设定对照，进行流式细胞术分析。为保证特异性，可加入未标记抗体或重组细胞因子进行阻断实验，排除非特异性结合。
二、核内因子染色步骤（菲恩生物K081试剂盒的实验步骤）
1）取100 μL细胞/管（约1×106个细胞）于流式管内；
2）[可选步骤]根据说明书进行FixableViability Dye（死活细胞鉴定染料）染色；
3） [可选步骤]根据实验需求对细胞悬液进行Fc受体封闭；
4）按照抗体说明书加荧光标记抗体染细胞表面Marker；
5）孵育完成后加入1mL细胞染色缓冲液[K079]，300×g离心5min，弃上清，再加入100uL细胞染色缓冲液[K079]重悬细胞；
6）加入1mL1×FixationWorking Solution，涡旋混匀，4℃反应30min，反应完后，600×g离心5min，弃上清；
7）加入2mL1×Permeabilization Working Solution，涡旋混匀，600×g 离心 5min，弃上清；
8）重复步骤7；
9）加入100μL1×Permeabilization Working Solution 重悬细胞；
10）按照抗体使用说明书加荧光标记的核染色抗体，混匀后室温避光孵育30min；
11）加入2mL1×Permeabilization Working Solution，600×g 离心 5 min，弃上清；
12）加入适量细胞染色缓冲液[K079]重悬细胞，即可上机检测。
经典案例（小鼠脾脏中foxp3染色案例）：
通过在CD4⁺ T细胞群中检测CD25和转录因子FOXP3的高表达，可用于识别调节性T细胞（Tregs）。该方法结合表面标志物和胞内转录因子的染色，有效区分免疫调节功能强的T细胞亚群。
小鼠脾脏中foxp3染色
胞内分子的染色与检测是识别细胞亚群及解析其功能状态的重要手段。与传统仅针对细胞表面抗原的染色不同，胞内染色需先对细胞进行固定，以稳定结构并交联蛋白质正规配资炒股，再进行破膜处理，使抗体能够进入细胞结合胞内或核内抗原。
发布于：湖北省天创网提示：文章来自网络，不代表本站观点。
相关文章
热点资讯
